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基础研究
长链非编码RNA GAS8-AS1在甲状腺微小乳头状癌中的表达特点及临床意义分析
中华内分泌代谢杂志, 2017,33(08): 687-692. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1000-6699.2017.08.011
摘要
目的

探讨长链非编码RNA(LncRNA)GAS8-AS1在甲状腺微小乳头状癌中的表达变化特点及临床意义。

方法

收集70例甲状腺微小乳头状癌(PTMC)患者及24例良性结节患者的新鲜组织标本,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术检测GAS8-AS1的表达差异,分析其表达水平与临床病理特征的相关性。

结果

GAS8-AS1在PTMC组织中表达与良性结节及癌旁组织比较均明显下降(P<0.05),且癌组织中GAS8-AS1的降低程度与颈部中央区淋巴结转移相关(P<0.05),多因素分析中GAS8-AS1仍为PTMC患者出现颈部中央区淋巴结转移的独立危险因素,GAS8-AS1鉴别PTMC患者是否出现淋巴结转移的ROC曲线下面积为0.7173(P<0.05)。

结论

GAS8-AS1有可能成为PTMC诊断及淋巴结转移预测的潜在分子标志物。

引用本文: 张冬雪, 刘欣, 陈振文, 等.  长链非编码RNA GAS8-AS1在甲状腺微小乳头状癌中的表达特点及临床意义分析 [J]. 中华内分泌代谢杂志,2017,33( 8 ): 687-692. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1000-6699.2017.08.011
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近年来甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma, PTC)发病率逐年攀升,且甲状腺微小乳头状癌(papillary thyroid microcarcinoma, PTMC)所占比例激增,但患者死亡率并未明显上升[1,2]。PTMC的"爆发"及其较强的生物学惰性,已经引发学界对PTMC"过度诊治"的思考[3]。但考虑到仍有一小部分PTMC进展迅速、出现转移、复发甚至死亡[4],评估肿瘤的侵袭性在为患者选择保守观察或积极手术治疗方案、解决"过度诊治"与"早期诊治"的矛盾时显得尤为重要。因此,寻找有效诊断PTMC及预测其侵袭性的分子标志物,成为解决这一问题的关键所在。

长链非编码RNA(long non-coding RNA, LncRNA)是长度超过200个核苷酸、具有调控基因表达作用的非编码RNA,能调控细胞凋亡、肿瘤浸润,影响肿瘤发生及预后,可作为肿瘤诊断及预后的新型分子标志物[5]。Pan等[6]在PTC组织中发现LncRNA GAS8-AS1 (GAS8 antisense RNA 1)表达明显下降,且下调的GAS8-AS1与肿瘤侵袭性密切相关。那么,GAS8-AS1在PTMC中是否也出现类似的改变、能否成为PTMC诊断、预后的分子标志物仍然有待探讨。

本研究通过比较GAS8-AS1在PTMC癌组织、癌旁组织及结节性甲状腺肿患者中的表达差异,分析其与颈部中央区淋巴结转移(Central Lymph Node Metastasis,CLNM)等临床侵袭性特征的相关性,为GAS8-AS1用于PTMC的诊断、预后评估提供理论依据。

对象和方法
一、 对象

收集2016年1月至2017年1月于北京世纪坛医院行手术治疗的70例PTMC患者的术中癌组织、相应的癌旁甲状腺组织标本,同时收集24例良性结节(结节性甲状腺肿,nodular goiter,NG)患者的甲状腺结节组织标本。所有组织均于液氮中速冻24 h后,放入-80℃冰箱储存。本研究纳入的所有患者均由2位病理科医师明确诊断为甲状腺微小乳头状癌或结节性甲状腺肿,所有患者术前均未接受其他治疗。70例PTMC患者年龄为(46.4±10.4)岁,男性占21.43%;24例NG患者年龄为(53.4±10.4)岁,其中男性占11.11%。本研究经北京世纪坛医院伦理委员会批准,所有患者均签署知情同意书。

二、 方法
1.总RNA提取、质量检测及cDNA合成:

每50 mg PTMC癌组织、癌旁组织及NG组织标本组织样品中加入1 ml的TRIZOL试剂(Invitrogen Life Technologies),用电动匀浆器进行匀浆。组织匀浆后在15℃~30℃孵育5 min,随后在每1 ml TRIZOL匀浆的样品中加入0.2 ml氯仿(上海化学试剂有限公司)。手动剧烈震荡15 s后,将样本在15℃~30℃孵育2~3 min、4℃离心机中12 000×g离心15 min后,将上层水相转移到新离心管中,加入异丙醇(1 ml TRIZOL:0.5 ml异丙醇)后混匀,并在15℃~30℃孵育10 min后于4℃下12 000×g离心10 min,可见管底部和侧壁上形成RNA沉淀。移去上清液,每1 ml TRIZOL试剂匀浆的样品中加入至少1 ml 75%乙醇,并清洗RNA沉淀。振荡后于4℃离心机中7 500×g离心5 min,去除上层乙醇溶液,空气中干燥RNA沉淀5~10 min,注意RNA沉淀不要完全干燥。溶解RNA时,先加入无RNA酶的水用枪反复吹打几次,然后55℃~60℃孵育10 min。获得的RNA溶液保存于-80℃冰箱中。使用NanoDrop® ND-1000测定RNA浓度和纯度,其中OD260/OD280要求在1.80~2.10之间,同时变性琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA完整性。使用SuperScript™ III Reverse Transcriptase(Invitrogen)、2.5 mmol/L dNTP混合液(dATP,dGTP,dCTP和dTTP各2.5 mmol/L)(HyTest Ltd)、Primer(英骏生物技术有限公司)及RT缓冲液(Invitrogen)在Gene Amp PCR System 9700(Applied Biosystems)中进行逆转录反应,获得cDNA。

2.实时荧光定量PCR(TR-qPCR)及产物测序:

LncRNA GAS8-AS1设计的引物(Primer 5.0)为5′-GACAAGACAACGAGCAAACAAG-3′和5′-GGAGCCT-CTAAAGGTCTGTGAC-3′;作为内参的β-actin的引物为5′-GTGGCCGAGGACTTTGATTG-3′和5′-CCTGTAA-CAACGCATCTCATATT-3′。采用2×PCR master mix(Arraystar)试剂盒,配成如下反应体系为2×Master Mix 5 μl,10 μmol/L引物各0.5 μl,cDNA 2 μl,加水至总体积为10 μl。将上述反应体系置于Realtime PCR(ViiA 7 Real-time PCR System, Applied Biosystems)仪上进行PCR反应。实验重复3次,结果使用2-ΔΔCt表示。将测序产物在ABI3730XL自动测序仪上进行Sanger测序。

三、 统计学处理

所有数据采用SPSS 23.0统计软件分析,定量资料使用 ±s 表示,定性资料采用数值或百分比表示,检验方差齐性及是否符合正态分布,并通过独立样本t检验比较均值,通过配对样本t检验比较癌与癌旁组织的差异,χ2检验分析GAS8-AS1与临床病理特征的相关性,受试者工作曲线ROC用于分析组织中GAS8-AS1在诊断PTMC及预测淋巴结转移的作用,通过logistic回归进行多因素分析,P<0.05为差异有统计学意义。

结果
一、 GAS8-AS1在PTMC组织的表达

本研究中,70例PTMC癌组织、癌旁组织及27例NG组织的RT-qPCR扩增产物溶解曲线为单峰(图1A),且产物核心序列测序结果(图1B)与NCBI数据库中GAS8-AS1完全匹配(图1C)。RT-qPCR检测结果提示GAS8-AS1在癌组织中的表达明显低于良性结节组(0.890 9±0.134 3,n=70对2.092 0±0.350 3,n=24, P=0.007 4,图2A)及癌旁甲状腺组织(n=70,P=0.003 2,图2C),且通过性别、年龄校正后,GAS8-AS1仍为良恶性鉴别的独立危险因素(P=0.016,表1)。GAS8-AS1鉴别甲状腺癌与结节性甲状腺肿的ROC曲线下面积为0.809 8(P<0.01,图2B),区分癌与癌旁组织的ROC曲线下面积也高达0.737 1(P<0.01,图2D)。

表1

多因素模型分析低水平GAS8-AS1与甲状腺微小癌鉴别诊断及颈部中央区淋巴结转移(CLNM)的相关性

Tab 1

Multivariate analysis of the association between reduced GAS8-AS1 expression and papillary thyroid microcarcinoma(PTMC)/central lymph node metastasis(CLNM)

表1

多因素模型分析低水平GAS8-AS1与甲状腺微小癌鉴别诊断及颈部中央区淋巴结转移(CLNM)的相关性

Tab 1

Multivariate analysis of the association between reduced GAS8-AS1 expression and papillary thyroid microcarcinoma(PTMC)/central lymph node metastasis(CLNM)

模型 Model低水平GAS8-AS1 Reduced LncRNA GAS8-AS1
OR95%CIP
甲状腺微小乳头状癌   
Papillary thyroid microcarcinoma   
 模型1Model 10.6310.433-0.9190.016
颈部中央区淋巴结转移   
Central lymph node metastasis   
 模型1Model 10.1210.017-0.8430.033a
 模型2Model 20.1170.016-0.8530.034a

注:LncRNA:长链非编码RNA Long non-coding RNA;模型1 Model 1:校正年龄、性别Adjusted for sex and age;模型2 Model 2:校正年龄、性别、被膜浸润、合并结节性甲状腺肿及合并桥本甲状腺炎Adjusted for sex, age, extrathyroidal extension, nodular goiter, and Hashimoto thyroiditis;aP<0.05

图1
RT-qPCR产物检测
Fig 1
Products of RT-qPCR

注:(A)GAS8-AS1扩增产物溶解曲线为单峰Single peak in melt curve for GAS8-AS1 products;(B)使用一代测序技术检测产物核心序列Sanger sequencing for PCR products;(C)检测序列与NCBI数据库比较完全一致Core sequence was the same as data in NCBI

图1
RT-qPCR产物检测
Fig 1
Products of RT-qPCR
图2
GAS8-AS1在不同组织中的表达及受试者工作(ROC)曲线
Fig 2
Expresion of GAS8-AS1 in different tissues and ROC curve

注:(A)GAS8-AS1在甲状腺微小乳头状癌(PTMC)与结节性甲状腺肿(NG)组织中的表达差异Different tissue GAS8-AS1 levels from papillary thyroid microcarcinoma(PTMC) and nodular goiter(NG) patients;(B)GAS8-AS1在鉴别PTMC与良性结节中的受试者工作(ROC)曲线ROC curve in differential diagnosis between PTMC and NG tissues;(C) GAS8-AS1在PTMC癌组织与癌旁组织中的表达差异GAS8-AS1 in cancer and para-cancer tissue in PTMC;(D)GAS8-AS1在鉴别癌与癌旁组织中的ROC曲线ROC curve for GAS8-AS1 in differential diagnosis between cancer and para-cancer tissue in PTMC; 组间比较Comparison between groups, aP <0.05,bP <0.01

图2
GAS8-AS1在不同组织中的表达及受试者工作(ROC)曲线
Fig 2
Expresion of GAS8-AS1 in different tissues and ROC curve
二、 组织中GAS8-AS1表达与PTMC临床病理特征的相关性分析

本研究根据GAS8-AS1表达水平的中位数(0.493 6),将PTMC分为低水平组(n=35)与高水平组(n=35),比较发现低水平组更易出现颈部中央区淋巴结转移(P<0.05,表2)。虽然低水平GAS8-AS1在男性、老年患者中比例更高,但差异并无统计学意义(P>0.05,表2)。此外,GAS8-AS1的表达水平与PTMC患者侵犯被膜、合并桥本甲状腺炎或结节性甲状腺肿等特征无显著相关性(P>0.05,表2)。

表2

PTMC患者组织中LncRNA GAS8-AS1的表达与临床病理特征的相关性(%)

Tab 2

Correlation between GAS8-AS1 in PTMC tissues and clinicpathological characteristics(%)

表2

PTMC患者组织中LncRNA GAS8-AS1的表达与临床病理特征的相关性(%)

Tab 2

Correlation between GAS8-AS1 in PTMC tissues and clinicpathological characteristics(%)

临床病理特征 Clinicpathological characteristicsLncRNA GAS8-AS1P
低水平组Low level(n=35)高水平组High level(n=35)
性别   
Sex   
 男性Male1050.244
 女性Female1530 
年龄(岁)   
Age(year)   
 <4512160.465
 ≥452319 
包膜外浸润   
Extrathyroidal extension   
 是Yes19181.000
 否No1617 
颈部中央区淋巴结转移   
Central cervical lymph node metastasis   
 是Yes9190.027
 否No2616 
合并结节性甲状腺肿   
Combined with nodular goiter   
 是Yes14141.000
 否No2121 
合并桥本甲状腺炎   
Combined with Hashimoto thyroiditis   
 是Yes541.000
 否No3031 

注:PTMC:甲状腺微小乳头状癌Papillary thyroid microcarcinoma;LncRNA:长链非编码RNA Long non-coding RNA

三、 组织中GAS8-AS1的表达与PTMC患者CLNM的相关性

PTMC伴CLNM的人群中GAS8-AS1表达水平为0.402 6±0.041 3(n=28),明显低于无中央区淋巴结转移(non-CLNM)组(0.866 6±0.163 5,n=42,P=0.025 7,图3A)。用年龄、性别等多种因素校正后,GAS8-AS1仍为PTMC患者出现CLNM的独立危险因素(P<0.05,表1)。绘制CLNM的ROC曲线,当预测点为0.569 3时,Yoden指数最大,曲线下面积(AUC)为0.7173(P=0.002,图3B),敏感度及特异度分别为52.38%、89.29%。

图3
LncRNA GAS8-AS1与中央区淋巴结转移(CLNM)的相关性
Fig 3
Association between GAS8-AS1 and central lymph node metastasis

注:(A)GAS8-AS1在中央区淋巴结转移组(CLNM)与无中央区淋巴结转移组(non-CLNM)中的表达差异Different tissue GAS8-AS1 levels from PTMC with and without CLNM;(B)其在预测CLNM中的ROC曲线ROC curve in differential diagnosis between LNM and non-LNM; 组间比较Comparison between groups, aP<0.05,bP<0.01

图3
LncRNA GAS8-AS1与中央区淋巴结转移(CLNM)的相关性
Fig 3
Association between GAS8-AS1 and central lymph node metastasis
讨论

甲状腺癌是内分泌系统最常见的恶性肿瘤,发病率在全球范围持续攀升[2,7,8]。美国近10年间,甲状腺癌发病率上升209%[2,9,10],我国甲状腺癌发病率在女性中已经超过子宫内膜癌及卵巢癌,成为前十位高发癌症[8],增长速度之快令人堪忧。甲状腺癌中PTC最为常见,约占甲状腺恶性肿瘤80%左右。世界卫生组织(WHO)将肿瘤最大径≤1 cm的PTC定义为PTMC。近年来SEER数据库显示,PTC中以PTMC的增长为主且速度最快,2014年世界卫生组织公布的全球癌症报告指出,甲状腺癌新发病例中PTMC超过50%。虽然甲状腺癌检出率激增,但死亡率并无明显升高,多数PTMC具有惰性生长的特点、死亡率极低、预后良好[11],提示甲状腺癌"过度诊断"、"多度治疗"的"海啸"已经悄然进入中国[3],造成患者的恐慌。但值得关注的是,少数PTMC极具侵袭性,因此,如何准确判断PTMC的侵袭性、做到恶性肿瘤"早期诊治"且同时避免"过度医疗",成为亟待解决的医学难题。积极寻找能够判断PTMC预后的有效标志物成为解决这一难题的有效途径。

LncRNA是长度超过200 nt、具有调控基因表达作用的非编码RNA,可作为肿瘤诊断及预后的分子标志物,在肿瘤发生、进展中发挥关键作用[5,12]。近年来,LncRNA在内分泌系统肿瘤中的作用也受到越来越多的关注[13]。Pan等[6]通过测序技术在PTC组织中发现了中国人群独有的突变基因LncRNA GAS8-AS1(c.713A>G/714T>C),突变频率为8.8%,仅次于BRAFv600e,成为中国人PTC中第二位突变基因。GAS8-AS1是生长停滞特异性基因(growth arrest specific 8,GAS8)第2位内含子的转录产物,长达994 nt。上述突变导致GAS8-AS1表达水平明显下降。虽然该突变频率较低,但该课题组在后续研究中纳入多个中心的87组新鲜标本(包野生型人群),发现甲状腺癌组织中GAS8-AS1的表达水平亦明显低于对照组,深入的细胞学实验进一步提示GAS8-AS1在甲状腺乳头状癌中有关键性的抑癌作用。本研究与上述研究一致,GAS8-AS1在PTMC癌组织中的表达也低于癌旁组织。此外,本研究发现GAS8-AS1在PTMC组织中的表达亦明显低于良性结节组织(NG),且通过年龄、性别校正后GAS8-AS1仍为PTMC的独立危险因素。由此可见,GAS8-AS1有望成为PTMC的新型诊断标志物。

颈部淋巴结转移是目前公认的甲状腺癌患者复发率增高及生存期降低的重要危险因素[14],20%~90%的甲状腺癌患者确诊时即存在淋巴结转移,以颈部中央区淋巴结转移(central lymph node metastasis,CLNM)最为常见[15],对术前发现的淋巴结进行清扫是有效降低复发的治疗手段。但遗憾的是,目前术前、术中检查诊断淋巴结转移均存在很大困难。超声在诊断CLNM中的表现并不理想,其敏感性只有30%~51%[16,17],且假阴性率高达30%[17]。11.7%~63.8%的颈部淋巴结转移在术前影像学和术中探查时被遗漏,最终在预防性中央区淋巴结清扫(central lymph node dissection,CLND)后确诊[18]。因此我国《甲状腺微小乳头状癌诊断与治疗专家共识(2016版)》[19]及《甲状腺结节和分化型甲状腺癌诊治指南》[20]中,推荐对PTC患者行同侧预防性颈部中央区淋巴结清扫,这无疑增加了手术难度及术后并发症。越来越多的循证医学证据发现,预防性CLND并未给大多数患者带来我们所预期的获益,且增加患者甲状旁腺功能减退及喉返神经损伤的风险,严重影响生活质量[21,22,23],因此,2015年ATA指南则不再推荐所有患者行预防性CLND[24]。目前,实施预防性CLND是否为"过度治疗"及如何合理地进行预防CLND再度成为学界争论的热点及PTMC治疗中的难点问题。本研究发现PTMC组织中lncRNA GAS8-AS1的低表达与颈部中央区淋巴结转移密切相关,且是淋巴结转移的独立危险因素,其预测颈部中央区淋巴结转移的AUC可达0.717 3。因此,检测PTMC组织中的lncRNA GAS8-AS1有可能为颈部中央区淋巴结转移的诊断提供理论依据,协助患者选择更加合适的手术方案。

本研究的局限性在于未能深入分析GAS8-AS1影响PTMC发生及淋巴结转移的具体作用机制,且未对术后患者进行血浆中GAS8-AS1表达的随访观察。本课题组拟进一步扩大样本量、建立多中心研究,进一步评估GAS8-AS1作为分子标志物在PTMC中诊断及预后中的作用。

综上所述,GAS8-AS1在PTMC癌组织中的表达下降,且下降程度与颈部中央区淋巴结转移密切相关。本研究可为GAS8-AS1应用于PTMC的诊断及淋巴结转移预测提供理论依据,为寻找PTMC的有效标志物、避免"过度诊治"提供新思路。

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关键词
主题词
长链非编码RNA
GAS8-AS1
甲状腺微小乳头状癌
临床标志物